当今市场上的液相色谱方法有两种不同的洗脱形式：等度洗脱或梯度洗脱。*初，所有液相色谱方法都是从等度泵开始的，因为市场上**个检测器（折射检测器或简称RI）只能与单一溶剂一起使用。但是随着UV检测器的出现，分离方法转向了梯度洗脱分析，以改善液相色谱峰形，并减少样品的分析时间。因此，当科学家开发现代梯度液相色谱方法时，将使用下面两种类型的泵中的一种进行分析：高压二元泵梯度洗脱、或者低压四元比例阀洗脱。
高压二元泵梯度泵的原理
在二元泵中，色谱一次只能将两种溶剂合并在一起以形成梯度。这是通过拥有两个独立的泵来完成的，每个泵为特定的溶剂提供流量。然后将溶剂在位于泵后的混合器中合并。因为溶剂在到达混合发生的混合点之前就已经处于高压下，所以这会形成高压配比形态。
举例来说，假设LC一种方法以65:35的比例运行溶剂A和溶剂B。如果LC目标流速为1.0 mL / min，则溶剂泵A将为溶剂A输送0.65 mL / min，溶剂泵B为溶剂B输送0.35 mL / min的流量。那么合并流量就会以设定的比例运行。
四元梯度比例阀的原理
低压四元梯度LC只有一个泵，用于将流动相输送到色谱柱。梯度是通过称为四元梯度比例阀的部件来实现的。四元梯度比例阀 结构为四个隔离溶剂电磁阀组成的阀组模块，出口合并为一路。四元阀通过打开四个溶剂阀的不同时间和频率来实现梯度，然后将混合溶剂传递给泵头。一旦将混合输送到泵，柱塞会将溶剂吸入泵头，并在湍流环境中将流动相混合在一起。
由于流动相在比例阀引入溶剂团的位置处没有压力，因此通常将四元梯度视为低压比例梯度。一些系统将增加一个混合室后泵，以在将梯度混合物输送到色谱柱之前进一步提高流动相的均质性。
例如，假设我们希望运行一种以25：25：25：25的比例运行溶剂A，B，C和D的方法。比例阀将打开每种溶剂的阀，以将相等比例的溶剂团输送到泵头。
可以以不同的方式创建和传递梯度。*初明显观察结论是，四元梯度系统允许使用者同时使用和混合多达四种不同的溶剂，从而提供了灵活性。另一方面，二元系统只能同时限制在两种不同的溶剂中。
梯度洗脱的方式的讨论：二元高压梯度洗脱和低压四元梯度洗脱
高效液相色谱仪器的泵或比例阀提供梯度，系统需要混合溶剂以确保将均匀的溶剂输送至液相色谱柱。当前的泵分为两类：高压混合（传统的二元泵）和低压混合（低压四元梯度）。
这两种混合模式之间有什么区别？
混合模式的影响
这两种混合模式对色谱的*大影响是对驻留体积的影响。驻留体积是从流动相开始混合至到达液相色谱柱为止的体积。该体积越大，新的流动相到达色谱柱所需的时间越长。
高压混合
在高压二元泵梯度系统的情况下，混合位置出现在混合室中，该混合室位于泵的千方。它的特点是系统的驻留体积较小，因为所测量的体积是从混合器到色谱柱的头部。这种较低的驻留体积特性导致二元液相色谱系统将梯度变化更快地传递到色谱柱，从而实现样品之间更快的再平衡。
低压混合
对于低压四元梯度系统，流动相开始混合的位置恰好在比例阀之后。因此，在考虑低压四元梯度系统中的驻留量时，必须考虑所有这些量：
· 从阀到泵头的体积
· 泵头的体积
· 从泵头到色谱柱的体积
低压四元梯度的优势
1. 低压四元梯度仅仅使用1个高压泵，节省了采购成本和维护成本。
2. 低压四元梯度可以使用4种溶剂，更为灵活。包括溶剂洗脱以及冲洗过程。
低压四元梯度的历史：
Spectra-Physics在1970年代末期**引入低压混合系统（三元）（SP8100）。 Perkin-Elmer（1983年的4系列）引入了使用双活塞串联泵的四元HPLC系统。如今，所有四元梯度洗脱都采用低压混合设计，其中高压泵从四元梯度比例阀中抽取流动相。通过控制打开每个溶剂阀来控制每个溶剂的通断频率和时间。
双活塞串联泵的**个活塞在低压下抽出溶剂，而**个活塞在高压下将混合后的溶剂推入色谱柱。通常，溶剂混合会在**个活塞缸内部进行，而在某些设计中可以在比例阀之后安装混合器，例如Agilent 1290四元梯度系统。低压混合的主要优点是固有的简单性和较低的成本，因为仅需要一个高压泵。
